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核酸提取及純化試劑盒

簡要描述:

PCR反應五要素:
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物: 引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

更新時間:2023-01-03

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核酸提取及純化試劑盒

RNA和DNA提?。?/span>

裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異,但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。

Chaotropes(離液劑)的作用:Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。

洗滌劑:除了離液劑外,裂解緩沖液中通常還有一些去污劑,以幫助蛋白質溶解和裂解。

jun酶和蛋白酶K:根據樣品類型,也可以使用酶進行裂解。

提取步驟:

1.從負八十冰箱取出樣品,放置于冰上緩慢解凍; (提前預冷離心機至4度)

2.待解凍后(紅色),加入200 μl氯仿(加入氯仿體積為Trizol體積的1/5),劇烈震蕩(乳白紅色),冰上靜置10 min。 (氯仿為有機溶劑,有效的使有機相和無機相迅速分離。有機相中主要是酚和蛋白結合,從而使得蛋白和RNA脫離,RNA進入水相。)

3.放置于預冷離心機,離心(4度,12000 rpm,15 min),離心后可見明顯分三層(上層無色透明水相為RNA層,中間很薄的乳白色為DNA層,下層為紅色為蛋白層)。

4.小心緩慢吸取上清,約400 μl(寧可少吸,也不要多吸?。?,置于另一個新的1.5 ml RNase-free EP管中,加入等體積的異丙醇,上下顛倒混勻,常溫靜置放置15 min。

5.離心(4度,12000 rpm,15 min),可見白色沉淀(有時細胞較少看不到沉淀,可放置負二十或負八十兩小時再繼續后面步驟)

6.棄上清,每管加入950 ul 75% 乙醇,上下顛倒混勻(切記不要用槍吹打混勻,這樣會造成RNA溶解)。

7.離心(4度,12000 rpm,10 min),可見底部明顯白色沉淀。

8.離心后,棄掉上清,放入離心機再次瞬離,用10 μl 的移液器洗去殘留液體, 開蓋晾干(約5 min)。

9.每個樣品根據沉淀大小加入適量DEPC水(一般20~30 μl,有時看不到沉淀,可加10 μl DEPC水溶解),吹打溶解RNA,十一樓酶標儀測濃度,OD值(260/280=1.8-2.0)標記,負八十保存。

備注:對于中性粒細胞提取RNA建議細胞數目大于2x106/樣品;

備注:操作過程中佩戴口罩。

特點優勢:

    1.特異性:所有產品使用的引物均經過詳盡的生物信息學分析,經過GenBank及自建龐大數據庫的比對,確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區段,可實現對細菌種屬及血清型的特異檢測,特異性均達到佳 。

    2.   重現性:該系列所有產品均經過大量實驗菌株的驗證,重現性為佳 。

    3.   靈敏性:該系列產品可實現對檢測菌的高靈敏檢測,當樣品中細菌的濃度達到103cfu/ml時,可實現對其的直接檢測,無需繁瑣的增菌過程。

    4.   實用性:檢測范圍廣,涵蓋了對人體危害較為嚴重的17種呼吸道及腸道致病菌,可實現對臨床樣品及其他環境取樣的快速檢測,整個檢測過程為3-4個小時。

    5.   優勢1:序列資源豐富,除GenBank公布的序列外,公司還進行了大量菌株的序列破譯,從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。

    6.   優勢2:該系列試劑盒均經過大量的保守性及特異性實驗驗證,憑借公司擁有的豐富的菌種資源,每一種檢測試劑盒均經過了20余種標準菌株和臨床菌株的保守性驗證及40余種近緣標準菌株和臨床菌株的特異性驗證,確保在使用過程中不會出現任何的假陽性及假陰性報告結果。

設計引物應遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3’端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3’端的堿基,特別是 末及倒數 個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列 有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。

注意事項

1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。

2.各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。

3.請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔di一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請再乘以總稀釋倍數(×n×5)。

4.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

5.底物請避光保存。

6.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

8.本試劑不同批號組分不得混用。

9.不能使用過期產品。

10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。 

 


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